一、服務(wù)介紹

Masson染色用于膠原纖維和肌纖維的染色及鑒定；染色結(jié)果：膠原纖維呈藍(lán)色、肌纖維呈紅色、細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。

二、實(shí)驗(yàn)原理

1.膠原纖維是人體中的結(jié)締組織的主要成分，分布在全身的各個(gè)部位，組成膠原纖維的主要成分是膠原蛋白。新鮮時(shí)呈白色，故一般稱為白色纖維。在HE染色中被染為淡紅色。它的性質(zhì)是具有韌性及緊固性，因此它能夠抵抗的牽拉力而不至于撕裂或拉斷它們常聚集成粗細(xì)不等的束，呈波浪狀。膠原纖維由許多根纖細(xì)的膠原纖維組成。在電鏡下膠原原纖維又由更細(xì)的原纖維構(gòu)成。根據(jù)Kramen和Little所進(jìn)行的電鏡研究證實(shí)，膠原纖維是特有的，具有橫紋的（重復(fù)期為650）原纖維。當(dāng)有病變時(shí)這些纖維可發(fā)生變形，常出現(xiàn)的就是膠原纖維的壞死，膠原纖維在稀酸里可發(fā)生膨脹，變成膠樣物。它們能被酸性染料染成深淺不一的粉紅色，這些往往跟淀粉樣物難以區(qū)別。由于它們的屈光率較弱，因而在光學(xué)顯微鏡下，很難與纖維區(qū)別。膠原纖維的分子長(zhǎng)度約為3000，直徑約為14，分子量為300000。

2.膠原纖維的組成：

1) 細(xì)胞內(nèi)合成前膠原蛋白分子，成纖維細(xì)胞攝取合成蛋白質(zhì)所需的氨基酸，包括脯氨酸、賴氨酸和甘氨酸。在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上按照特定的膠厚mRNA的堿基序列，合成前α-多肽鏈。后者邊合成邊進(jìn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，并在羥化酶的作用下，將肽鏈中的脯氨酸和賴氨酸羥化經(jīng)羥化后，三條前α-多肽鏈互相纏繞成繩索狀的前膠原蛋白分子。溶解狀態(tài)的前膠原蛋白分子，兩端未纏繞，呈球狀構(gòu)形，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔風(fēng)或轉(zhuǎn)移到高爾基復(fù)合體內(nèi)加入糖基后，分泌到細(xì)胞外。

2) 厚膠原蛋白分子的細(xì)胞外聚合。細(xì)胞外的前膠原蛋白分子，在肽內(nèi)切酶的作用下，切去分子兩端球狀構(gòu)表部分，形成厚膠原蛋白分子，粗約1.5nm，長(zhǎng)約300nm，厚膠原蛋白分子平行排列聚合成膠原纖維。聚合時(shí)，相互平的相鄰分子錯(cuò)開1/4分子長(zhǎng)度，同一排的分子，菌尾相對(duì)并保持距離，聚合成束，于是形成具有64nm周期橫紋的膠原原纖維。聚合時(shí)，分子內(nèi)，分子間的化學(xué)基因進(jìn)行縮合，交聯(lián)，增加厚纖維的穩(wěn)固性。若干膠原原纖維經(jīng)糖蛋白粘合成粗細(xì)子等的膠原纖維。中性自溶型膠原（neutrla-soluble collagen）→醛糖、縮醛類脂/肉豆蔻酸、類脂→不溶型膠原（insoluble collagen）

3.膠原纖維的顯示：

膠原纖維在HE染色法被染成粉紅色，除此之外，它還可以用一些陰離子的染料來進(jìn)行染色，如用淡綠可把它們?nèi)緸榫G色，用甲苯胺藍(lán)可將其染為藍(lán)色，在網(wǎng)狀纖維染色中，如不加以處理，它又可被染為棕黃色。常用的特殊染色法有Van Gieson.Masson和Mallary等方法。在**細(xì)胞化學(xué)染色中，膠原纖維由于含的負(fù)電荷過多，常導(dǎo)致某些非特異性的染色，應(yīng)特別注意。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1.Van Gieson（V.G）染色法

1）試劑的配制：

weigert氏蘇木素

A液： 蘇木素 1g （haematoxylin）+ 無水酒精 100ml

B液： 30%三氯化鐵 4ml （ferric chloride）+蒸餾水 95ml+鹽酸 1ml

Van Gieson氏液

A液： 酸性品紅 1g（acid fuchsin）+蒸餾水  100ml

B液： *飽和水溶液，（1.22%）（picric acid）

注意事項(xiàng)：

Weigert氏蘇木素臨用前取A液和B液等份混合，幾個(gè)小時(shí)內(nèi)用完，長(zhǎng)不得過*。

蘇木素配后經(jīng)二十多天才能成熟，提前配制。

該液能抵抗弱酸性染液，對(duì)已著染的細(xì)胞核在酸性染液的作用，不易被脫去顏色，如果不特別深染，則無須分化。

Van Gieson氏液取B液9ml，加入A液1ml，即可使用。

2）操作方法：（后面的各種方法，如沒特別說明，都在室溫下進(jìn)行）

切片脫蠟至水

用Weigert氏蘇木素染20min

水洗，必要時(shí)可分化

流水沖洗10min

染Van Gieson氏液1min

用95%酒精快速分化

無水酒精脫水，二甲苯透明，封固。

結(jié)果：

膠原纖維：鮮紅色，肌纖維： 黃*色，紅細(xì)胞： 黃*色，細(xì)胞核： 藍(lán)黑或灰色。

注意事項(xiàng)：

該法染完的切片，較易褪色如需照相，應(yīng)盡早完成。

蘇木素染液如為棕色或沉淀，應(yīng)將其拋棄。

分化用的酒精，應(yīng)使用95%以上的酒精，低濃度的酒精褪色能力強(qiáng)，容易將著染的紅色脫去。

切片也可以用天青蘭蘇木素替代Weigert氏蘇木素，染核效果基本一樣。

2.Masson氏三色染色法：

1）相關(guān)試劑的配制：

天青石藍(lán)液的配制：

天青石藍(lán)（Celestin blue B） 1.25g

硫酸鐵銨（ferric ammonium sulfate）1.25g

蒸餾水 200ml

甘油（glycerin） 30ml

將前兩者溶于蒸餾水中，然后煮沸，冷卻后過濾，再加入甘油和麝香草酚。

Mayer氏蘇木素的配制：

蘇木素 0.1g

蒸餾水 100ml

鉀明礬（Potassium alum） 5g

檸檬酸（Citric acid） 0.1g

水合氯醛（Chloral hydrate）20mg

配制法：

將蘇木素放入蒸餾水中，用玻棒不停地?cái)嚢柚敝寥芙?，再依次加入鉀明礬，檸檬酸和水合氯醛，再繼續(xù)攪拌，后加入碘酸鈉，攪拌均勻，即可使用。

麗春紅酸性品紅液的配制：

麗春紅（ponceau 2R） 0.7g

酸性品紅（acid fuchsin）0.3g

冰醋酸 1ml

蒸餾水 99ml

2）操作方法：

A 切片脫蠟至水，

B 1%高錳酸鉀氧化切片5min，

C 水洗，草酸漂白1min，

D 水洗，蒸餾水洗，天青石藍(lán)染5min水洗，

E 摔去余液不用水洗，滴染Mayer氏蘇木素3-5min，

F 流水沖洗5-10min，

G 麗春紅*飽和液染5min，

H 1%醋酸水溶液洗，

I 1%磷鉬酸分化切片約5min，

J 蒸餾水洗，

K 1%淡綠或者甲苯胺藍(lán)滴染30s，

L 1%醋酸水溶液洗切片，

M 95%酒精分化，無水酒精脫水，

N 二甲苯透明，中性樹膠封固。

3）結(jié)果： 

膠原纖維呈現(xiàn)綠色或藍(lán)色，細(xì)胞核呈現(xiàn)灰黑或灰藍(lán)色，肌肉和胞質(zhì)紅細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。

4）注意事項(xiàng)：

① Masson氏染液配完后保存時(shí)間不宜過長(zhǎng)，如有可能，每次染色以染配為佳，如何可使著色顏色的鮮艷性。

② 切片在各級(jí)酒精中脫水，時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)將著染的顏色脫去。

③ 切片保存所著染的顏色顯長(zhǎng)為1-2年以后會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸褪去，應(yīng)予注意。

④ 磷鉬酸和磷鎢酸在染色法中的作用各有不同，磷鉬酸作用于膠原纖維，磷鎢酸作用于纖維膠]質(zhì)，肌膠質(zhì)，神經(jīng)膠質(zhì)和上皮纖維等。上述兩種試劑的使用，可以促進(jìn)組織有選擇的染色，它們可以減少背景和核的染色，使背景清晰。

⑤ 如有可能，在組織固定時(shí)，用Zenker氏固定液固定，如此對(duì)染色效果將更好。