腦科學(xué)研究是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向，直接的腦顯微成像是研究大腦結(jié)構(gòu)及功能的有效手段。多光子顯微成像信噪比高、成像深度大、光漂白與光毒性小，近年來(lái)發(fā)展迅速，被廣泛應(yīng)用于腦成像研究中。

南京理工大學(xué)電子工程與光電技術(shù)學(xué)的薛璐團(tuán)隊(duì)發(fā)表文章，描述了多光子顯微成像技術(shù)的原理及系統(tǒng)組成，結(jié)了近年來(lái)腦成像應(yīng)用中，多光子顯微成像在成像速度、成像深度及系統(tǒng)小型化三個(gè)方面的進(jìn)展，并展望了其未來(lái)發(fā)展前景。

研究背景

腦科學(xué)作為極具發(fā)展前景的領(lǐng)域，開(kāi)展基礎(chǔ)腦功能及腦部疾病的研究對(duì)人工智能、教育及醫(yī)療等諸多領(lǐng)域的發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。大腦是人體*為復(fù)雜和神秘的器官，深入理解其結(jié)構(gòu)與功能的運(yùn)作機(jī)制，是解鎖眾多科學(xué)與技術(shù)難題的關(guān)鍵。

目前，計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（PET）、功能性磁共振成像（FMRI）等技術(shù)在基礎(chǔ)研究及臨床醫(yī)療中廣泛應(yīng)用于大腦結(jié)構(gòu)及功能成像。然而，這些方法的空間分辨率處于厘米量級(jí)，僅能確定較為粗糙的結(jié)構(gòu)及功能改變，難以滿足對(duì)大腦微觀世界深入探索的需求。

與之相比，光學(xué)顯微方法中的多光子成像技術(shù)（Multiphoton Microscopy，MPM）脫穎而出。它具備亞細(xì)胞分辨率以及三維和深度成像能力，并且光漂白和光毒性小。多光子顯微鏡能夠?qū)ν暾竽X中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管結(jié)構(gòu)、神經(jīng)元回路、樹(shù)突棘以及亞細(xì)胞成分等進(jìn)行高空間分辨率成像，為研究大腦生理過(guò)程以及阿爾茨海默病、腦卒中、腦腫瘤等典型腦部疾病提供了強(qiáng)有力的工具。

隨著腦科學(xué)研究的不斷深入，對(duì)腦成像技術(shù)提出了更高的要求。在成像深度方面，需要能夠?qū)ζ酉路饺绾ｑR體、丘腦、下丘腦等更深處的腦區(qū)進(jìn)行成像；成像速度上，要足夠快以記錄神經(jīng)元的快速活動(dòng)；裝置靈活性方面，期望有更小的成像裝置以便對(duì)運(yùn)動(dòng)的樣本進(jìn)行靈活成像。這些需求促使研究人員對(duì)多光子顯微鏡不斷進(jìn)行創(chuàng)新與改進(jìn)，以提升其性能。

多光子成像技術(shù)簡(jiǎn)介

一、原理

多光子顯微鏡的成像原理基于短脈沖激光與樣品相互作用時(shí)產(chǎn)生的非線性光學(xué)效應(yīng)，主要包括激發(fā)熒光和諧波產(chǎn)生。

1、多光子激發(fā)熒光成像（2PEF和3PEF）

雙光子熒光顯微術(shù)（two-photon excited fluorescence microscopy，2PEF）和三光子熒光顯微術(shù)（three-photon excited fluorescence microscopy，3PEF）利用多光子同時(shí)被熒光物質(zhì)吸收，使其躍遷到高能級(jí)，經(jīng)過(guò)振動(dòng)態(tài)的無(wú)輻射躍遷后輻射出熒光光子。其中，2PEF輻射出的熒光光子頻率略小于激發(fā)光頻率的2倍，3PEF輻射出的熒光光子頻率略小于激發(fā)光頻率的3倍。這種成像方式通過(guò)收集輻射光子信號(hào)來(lái)構(gòu)建圖像。

非線性光學(xué)躍遷過(guò)程能級(jí)圖

多光子激發(fā)熒光的信號(hào)來(lái)源廣泛，可來(lái)自外源探針、熒光蛋白或內(nèi)源性組織分子。內(nèi)源性組織分子產(chǎn)生的多光子自熒光已被用于識(shí)別和定量煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、色氨酸等代謝分子，但存在可監(jiān)測(cè)分子種類(lèi)有限和內(nèi)源信號(hào)強(qiáng)度弱的局限性。為增強(qiáng)信號(hào)，大量抗體和熒光標(biāo)記物被開(kāi)發(fā)用于標(biāo)記感興趣的組織成分，如Ca2?指示劑、遺傳編碼的電壓指示劑等。

2、諧波成像（SHG和THG）

二次諧波（second harmonic generation，SHG）和三次諧波（third harmonic generation，THG）成像利用處于基態(tài)的分子在吸收多個(gè)光子后到達(dá)虛擬能級(jí)，然后直接輻射出高頻光子的原理。SHG輻射出的光子頻率是入射光子頻率的2倍，THG輻射出的光子頻率是入射光子頻率的3倍。諧波信號(hào)的產(chǎn)生與樣本材料的非線性極化率相關(guān)，反映了樣本材料的微觀特性，如電子態(tài)、分子的對(duì)稱(chēng)性、旋向及排列等。

SHG通常發(fā)生在具有非中心對(duì)稱(chēng)性的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，如膠原蛋白、肌球蛋白、微管、絲、淀粉和纖維素等；THG則常用于高折射率物質(zhì)或兩種折射率均勻材料的界面成像，如細(xì)胞膜、脂滴、彈性蛋白纖維、鈣化骨和膠原束或肌肉纖維等。

3、多光子成像技術(shù)的特點(diǎn)

多光子成像技術(shù)在對(duì)同一種熒光物質(zhì)成像時(shí)，使用的激發(fā)波長(zhǎng)比單光子長(zhǎng)，波長(zhǎng)越長(zhǎng)的激發(fā)光在生物組織中穿透能力越強(qiáng)，有效解決了生物組織中深層物質(zhì)的成像問(wèn)題。

多光子激發(fā)是一個(gè)非線性過(guò)程，只有在激發(fā)光焦點(diǎn)附近的有限區(qū)域才能達(dá)到產(chǎn)生熒光所需的激光照射功率密度，非焦點(diǎn)區(qū)域不會(huì)產(chǎn)生熒光，減少了焦點(diǎn)外的光漂白和光毒性，適合活體的長(zhǎng)時(shí)間成像。

多光子成像通過(guò)對(duì)焦點(diǎn)的三維移動(dòng)即可獲得樣品的三維顯微圖像，具有天然的光學(xué)層析和三維成像能力，在腦成像領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

二、典型光路

典型多光子顯微鏡主要由以下幾個(gè)關(guān)鍵部分組成：

典型多光子顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖

1、激光光源

多光子顯微鏡需要高時(shí)空相干性的短脈沖激光來(lái)提高多光子效率，與傳統(tǒng)寬場(chǎng)熒光顯微鏡采用的連續(xù)激光不同。鎖模摻鈦藍(lán)寶石（Ti:Sapphire）激光器和光纖飛秒激光器是常用的光源，結(jié)合光參量振蕩器（Optical Parametric Oscillator，OPO）或光參量放大器（optical parametric amplifiers，OCA）可獲得波長(zhǎng)更長(zhǎng)的激光，通過(guò)改變相位匹配條件還能實(shí)現(xiàn)多波長(zhǎng)寬帶可調(diào)諧輸出。不同成像場(chǎng)景對(duì)激光源的物理參數(shù)，如平均功率、脈沖持續(xù)時(shí)間、重復(fù)頻率、激發(fā)波長(zhǎng)和光譜帶寬等有不同要求。

2、光學(xué)掃描模塊

掃描模塊對(duì)系統(tǒng)成像速度影響較大，目前多數(shù)多光子顯微鏡使用振鏡進(jìn)行2D掃描，同時(shí)共振掃描儀和一些非機(jī)械掃描機(jī)制的出現(xiàn)進(jìn)一步提高了成像速度。

3、低倍率高數(shù)值孔徑物鏡

物鏡從全視場(chǎng)收集信號(hào)，其數(shù)值孔徑越大，收集到的光越多，分辨率越高。多光子顯微鏡通常配備高數(shù)值孔徑物鏡，并且要求物鏡在近紅外光波段具有高透過(guò)率，以減小激發(fā)光的損耗。在對(duì)高光散射樣品成像時(shí)，低倍率高數(shù)值孔徑物鏡與高靈敏度、低噪聲GaAsP光電倍增管配合使用可提高檢測(cè)效率和圖像信噪比。

4、二向色鏡和光電探測(cè)器

激光源發(fā)出的光束經(jīng)掃描器掃描后，通過(guò)二向色鏡及物鏡聚焦在樣品上，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光信號(hào)和諧波信號(hào)，這些信號(hào)被物鏡收集并沿原光路返回，二向色鏡將多光子激發(fā)的信號(hào)從激發(fā)光中分離出來(lái)，引導(dǎo)至光電探測(cè)器。通常多光子激發(fā)熒光成像和諧波成像可在同一裝置上實(shí)現(xiàn)，通過(guò)在探測(cè)器前設(shè)置濾波片可在光譜上分離不同信號(hào)。

多光子腦成像成像深度進(jìn)展

一、長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)

1、激發(fā)光和發(fā)射光衰減對(duì)成像深度的影響

在多光子腦成像中，激發(fā)光和發(fā)射光在生物組織中的衰減嚴(yán)重制約了成像深度。增加激光源脈沖能量雖能增強(qiáng)激發(fā)光穿透深度，但會(huì)帶來(lái)諸多弊端，如提高激光系統(tǒng)成本和復(fù)雜性、誘發(fā)多光子電離和光損傷，以及導(dǎo)致失焦和近表面熒光激發(fā)等問(wèn)題。

2、長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)的優(yōu)勢(shì)與實(shí)現(xiàn)方式

采用波長(zhǎng)更長(zhǎng)的激發(fā)光進(jìn)行成像可顯著減少組織散射和吸收，避免高能脈沖帶來(lái)的問(wèn)題，是提高成像深度的有效方法。目前多光子顯微鏡常采用Ti:Sapphire激光器產(chǎn)生的700-1100nm飛秒脈沖激發(fā)，為提升成像深度，研究人員開(kāi)發(fā)了1300nm窗口（由光參量振蕩器、光參量放大器或Cr:forsterite激光器產(chǎn)生）和1700nm窗口（由光孤子源激發(fā)）。這些窗口在腦組織中的衰減呈現(xiàn)局部*小值，有利于將彈道光子傳遞到焦點(diǎn)。例如，Demirhan Kobat等人采用1280nm激發(fā)對(duì)小鼠大腦中熒光標(biāo)記的脈管系統(tǒng)成像，達(dá)到了散射組織中多光子成像的基本深度極限；Dimitre G.Ouzounov等人使用1300nm激發(fā)的三光子成像對(duì)小鼠海馬體中的神經(jīng)元成像，成像深度約1mm；H Cheng 等人采用圓偏振孤子自頻移技術(shù)在1617nm處產(chǎn)生高能飛秒脈沖，對(duì)小鼠體內(nèi)深腦脈管系統(tǒng)成像，深度達(dá)2000μm；Hongji Liu等人使用自制飛秒激光器進(jìn)行1700nm窗口的三光子激發(fā)，實(shí)現(xiàn)了小鼠大腦表面以下2100μm血管的可視化及1600μm深度處的血流動(dòng)力學(xué)成像。此外，2200nm窗口在生物組織中的衰減也呈局部*小值，但成像深度和空間分辨率不如1700nm激發(fā)，因此1700nm窗口仍是當(dāng)前實(shí)現(xiàn)*深多光子腦成像的光學(xué)窗口。

成年小鼠體內(nèi)Qtracker655 標(biāo)記的深腦脈管系統(tǒng)的三光子顯微成像

二、結(jié)合自適應(yīng)光學(xué)

1、成像質(zhì)量下降的原因

盡管長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)可減輕散射效應(yīng)，但隨著成像深度增加，成像質(zhì)量會(huì)迅速下降。這是因?yàn)椴痪鶆虻臉颖緯?huì)使激發(fā)光的波前發(fā)生畸變，引入偽影。此外，高數(shù)值孔徑油鏡的浸入介質(zhì)與樣品之間的折射率不匹配、光學(xué)元件的離軸傳輸以及光學(xué)元件的缺陷等因素都會(huì)導(dǎo)致像差，使激發(fā)光的焦點(diǎn)光斑尺寸增大且強(qiáng)度減小，限制了深層組織的高質(zhì)量成像。

2、自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)的應(yīng)用與效果

自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)是解決多光子成像波前校正的主要方法，其典型系統(tǒng)包括波前探測(cè)和波前校正兩個(gè)部分。波前探測(cè)分為直接波前測(cè)量法（利用波前傳感器直接測(cè)量畸變波前，測(cè)量速度快，但需引入外源染料，不利于厚組織或多層樣品）和間接波前探測(cè)法（基于迭代算法，通過(guò)一系列圖像間接推導(dǎo)出波前，速度較慢但適合不透明介質(zhì)，其替代方案如相干門(mén)控波前傳感、瞳孔分割和自適應(yīng)迭代補(bǔ)償技術(shù)等廣泛應(yīng)用于腦部組織成像）。波前校正器（如可變形鏡和空間光調(diào)制器）通過(guò)改變波前相位來(lái)校正畸變波前。

許多自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于多光子顯微鏡。S.Leemans等人開(kāi)發(fā)的3D自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)，在顯微鏡激發(fā)路徑中集成可變形鏡，采用基于下坡單純形算法的波前優(yōu)化方法，能對(duì)小鼠大腦 2mm深度處的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元成像，提高了圖像分辨率和亮度；Lina Streich等人將自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)應(yīng)用于三光子顯微鏡進(jìn)行小鼠大腦活體成像，采用實(shí)時(shí)心電圖門(mén)控圖像采集方案減少運(yùn)動(dòng)偽影，結(jié)合基于模態(tài)的間接AO法與連續(xù)膜可變形鏡，可對(duì)皮層和海馬體中的精細(xì)結(jié)構(gòu)成像，圖像質(zhì)量和空間分辨率顯著改善，軸向分辨率提升四倍，熒光信號(hào)增強(qiáng)八倍。

三、結(jié)合GRIN透鏡

1、現(xiàn)有措施的局限性與內(nèi)窺鏡檢查方式的引入

盡管采取了上述措施，在小鼠大腦中成像深度仍限制在1-2mm。為對(duì)更深層皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)成像，可采用內(nèi)窺鏡檢查方式，通過(guò)插入薄成像探針觀察器官內(nèi)部，其中GRIN透鏡被廣泛用于大腦體內(nèi)成像。

2、GRIN透鏡的特點(diǎn)與應(yīng)用實(shí)例

GRIN透鏡是微型棒狀透鏡，具有接近拋物線形狀的徑向折射率曲線，直徑可小于1mm，能嵌入組織內(nèi)部傳遞激發(fā)和發(fā)射光。結(jié)合高數(shù)值孔徑GRIN透鏡的多光子內(nèi)窺鏡技術(shù)可解析深層組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。例如，Miriam E.Bocarsly等人開(kāi)發(fā)的微創(chuàng)多光子微內(nèi)窺鏡系統(tǒng)，采用0.5NA、直徑0.5mm的GRIN透鏡，結(jié)合遺傳編碼鈣指示劑GCaMP6s，能對(duì)小鼠大腦深層結(jié)構(gòu)（如紋狀體、黑質(zhì)和外側(cè)下丘腦）的神經(jīng)元和神經(jīng)元活動(dòng)進(jìn)行雙光子熒光成像；Masaaki Sato等人采用直徑1.8mm、長(zhǎng)度16.9mm的GRIN透鏡和電可調(diào)透鏡構(gòu)成的快速變焦雙光子微內(nèi)窺鏡系統(tǒng)，可使麻醉小鼠的CA1海馬體和杏仁核神經(jīng)元可視化；Yu-Feng Chien等人將GRIN透鏡和可調(diào)諧聲學(xué)GRIN透鏡集成到雙光子顯微鏡中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠大腦底部視交叉上核自發(fā)神經(jīng)元活動(dòng)的體內(nèi)功能成像。然而，GRIN透鏡固有像差會(huì)限制成像分辨率和視野，可結(jié)合電可調(diào)液晶透鏡、衍射和折射光學(xué)元件、自適應(yīng)光學(xué)器件等進(jìn)行校正。此外，GRIN透鏡植入大腦可能導(dǎo)致組織創(chuàng)傷，開(kāi)發(fā)非侵入性方法仍是深層腦組織成像的需求。

多光子腦成像成像速度進(jìn)展

一、隨機(jī)掃描

1、傳統(tǒng)掃描機(jī)制的局限性與隨機(jī)掃描的優(yōu)勢(shì)

多光子成像速度受激發(fā)焦點(diǎn)連續(xù)掃描速度限制，典型雙光子顯微鏡幀速率較慢。傳統(tǒng)多光子顯微鏡使用振鏡進(jìn)行2D掃描，雖有共振掃描儀等快速掃描機(jī)制，但仍受掃描鏡物理速度限制且需克服慣性。隨機(jī)掃描機(jī)制可有效避免這些問(wèn)題，激光束能在整個(gè)視場(chǎng)任意選定點(diǎn)快速掃描，可只掃描感興趣點(diǎn)，且由于激光束在信號(hào)產(chǎn)生區(qū)域停留時(shí)間增加，系統(tǒng)獲取信號(hào)量增多，圖像信噪比得以提高。

2、隨機(jī)掃描的實(shí)現(xiàn)方法與補(bǔ)償方案

實(shí)現(xiàn)隨機(jī)掃描常用聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD），其通過(guò)聲光衍射效應(yīng)使入射光在一定角度范圍內(nèi)掃描，掃描頻率可250KHz，且所有掃描位置激光功率均勻，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D隨機(jī)掃描。例如，Kelly D.R.Sakaki等人開(kāi)發(fā)的雙光子顯微鏡采用兩個(gè)AOD進(jìn)行X軸和Y軸掃描及壓電致動(dòng)器進(jìn)行Z軸掃描，能對(duì)神經(jīng)元樹(shù)突棘進(jìn)行高分辨率飽和采樣。然而AOD會(huì)引入空間和時(shí)間色散，導(dǎo)致脈沖展寬和光束失真，降低信號(hào)強(qiáng)度和圖像質(zhì)量。為解決此問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)了多種補(bǔ)償方案，如使用擴(kuò)散光柵等色散元件在相反方向引入空間色散來(lái)*小化量，或使用棱鏡或額外AOD校正空間和時(shí)間色散，使基于AOD的掃描機(jī)制廣泛應(yīng)用于多光子顯微鏡，實(shí)現(xiàn)高時(shí)空分辨率的隨機(jī)掃描。

二、多焦點(diǎn)成像

1、多焦點(diǎn)成像的原理與優(yōu)勢(shì)

多焦點(diǎn)成像通過(guò)同時(shí)激發(fā)和檢測(cè)多個(gè)位置的信號(hào)來(lái)提高數(shù)據(jù)獲取速度且不損失信噪比，成為提升多光子成像速度的策略。在多焦點(diǎn)成像中，一束平行光垂直入射到多焦點(diǎn)光學(xué)元件后在軸向或垂軸平面形成多個(gè)焦點(diǎn)，常用多焦點(diǎn)光學(xué)元件包括Nipkow盤(pán)、分束器陣列、微透鏡陣列、衍射光學(xué)元件和空間光調(diào)制器等。

2、多焦點(diǎn)成像技術(shù)的應(yīng)用與問(wèn)題解決

Chenyang Wen等人利用二元全息圖控制聚焦光點(diǎn)位置和強(qiáng)度，結(jié)合多焦點(diǎn)壓縮傳感算法重建3D圖像，提高了成像性能；Simon P.Poland等人開(kāi)發(fā)的多焦點(diǎn)多光子熒光壽命顯微鏡包含8×8快光束陣列，通過(guò)并行激發(fā)和檢測(cè)使采集速度大幅提高。然而，多焦點(diǎn)多光子技術(shù)存在成像質(zhì)量和速度的矛盾，增加焦點(diǎn)數(shù)目可提高速度，但會(huì)因焦點(diǎn)間相干干擾降低分辨率。通過(guò)不同光束的相位復(fù)用、使用不同偏振態(tài)光束以及延長(zhǎng)每個(gè)焦點(diǎn)相對(duì)于相鄰焦點(diǎn)的時(shí)間等方法可有效解決此問(wèn)題。

三、貝塞爾光束照明

1、擴(kuò)展焦深成像與貝塞爾光束的特點(diǎn)

在多光子三維成像中，傳統(tǒng)掃描方式耗時(shí)多，擴(kuò)展焦深成像通過(guò)犧牲軸向圖像信息，利用貝塞爾光束擴(kuò)展焦深，在一次橫向掃描中實(shí)現(xiàn)體積掃描，可大大提高成像速度，適用于高時(shí)間分辨率的稀疏群體結(jié)構(gòu)成像，如神經(jīng)元活動(dòng)的功能成像。貝塞爾光束具有軸向延展的針狀光強(qiáng)度分布，在保持橫向分辨率的同時(shí)延伸了焦深，能同時(shí)從不同深度獲取信號(hào)。對(duì)于標(biāo)記較稀疏的樣品，長(zhǎng)焦深貝塞爾光束可監(jiān)測(cè)更大體積活動(dòng)；對(duì)于標(biāo)記密集的樣品，短焦深貝塞爾光束可減少結(jié)構(gòu)重疊。

2、貝塞爾光束在多光子顯微鏡中的應(yīng)用實(shí)例

Bingying Chen等人將貝塞爾光束照明應(yīng)用于三光子顯微鏡，對(duì)活果蠅大腦特定區(qū)域成像，速度達(dá)1Hz，相比點(diǎn)掃描三光子顯微鏡優(yōu)勢(shì)明顯；Rongwen Lu等人開(kāi)發(fā)的基于軸錐鏡的貝塞爾光束模塊成本低、占用空間小且對(duì)光偏振不敏感，集成到雙光子熒光顯微鏡中對(duì)斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)神經(jīng)元成像，速度達(dá)50Hz，能對(duì)更多神經(jīng)元成像；Jiang Lan Fan等人使用具有軸向擴(kuò)展貝塞爾焦點(diǎn)的雙光子激光掃描顯微鏡進(jìn)行神經(jīng)血管動(dòng)力學(xué)成像，實(shí)現(xiàn)了大體積（1.4mm×1.4mm×110μm）和高速（99Hz）下的結(jié)構(gòu)和功能成像，且橫向分辨率足以解析單個(gè)毛細(xì)血管，表明貝塞爾焦點(diǎn)掃描在提高體積成像通量的同時(shí)不影響橫向分辨率。

基于軸錐鏡的具有連續(xù)可調(diào)焦深貝塞爾模塊的光學(xué)原理圖

多光子腦成像裝置小型化

一、傳統(tǒng)裝置的局限性與小型化的必要性

傳統(tǒng)多光子腦成像通常依賴大型臺(tái)式顯微鏡，動(dòng)物頭部需固定在物鏡下方，這嚴(yán)重限制了可研究的行為類(lèi)型，給動(dòng)物帶來(lái)不適和壓力。因此，將掃描機(jī)構(gòu)、光學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)收集組件和飛秒激光器小型化，發(fā)展頭戴式多光子顯微鏡成為重要研究方向。

二、掃描機(jī)制與激光源的探索

研究人員探索了多種適用于微型雙光子顯微的掃描機(jī)制，其中光纖掃描頭和微機(jī)電系統(tǒng)（Microelectro Mechanical Systems，MEMS）掃描鏡較為常見(jiàn)。MPM的典型激光源 Ti:Sapphire快激光器體積龐大、對(duì)準(zhǔn)要求高，不適用于臨床環(huán)境，而光纖激光器結(jié)構(gòu)緊湊、無(wú)需對(duì)準(zhǔn)且價(jià)格便宜，在微型化系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。聚焦光學(xué)系統(tǒng)的小型化可通過(guò)使用緊湊的高數(shù)值孔徑光學(xué)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

三、小型化顯微鏡的發(fā)展歷程與實(shí)例

1、早期嘗試與不足

2001年，Denk等人研制出*臺(tái)光纖共振掃描雙光子頭戴式顯微鏡，但成像性能不佳。2009年，Kerr等人展示的小型化雙光子光纖內(nèi)窺鏡系統(tǒng)雖空間分辨率有所提高（因應(yīng)用微型物鏡NA 0.9），但探頭重量增加（5.5g），且由于仍使用光纖共振掃描，成像速度較慢。同年，M.J.Schnitzer等人建造的基于MEMS掃描儀的便攜式雙光子顯微鏡重量?jī)H2.9g，*對(duì)小鼠大腦新皮質(zhì)表面附近血管成像，但其掃描頻率（對(duì)于400×135像素約為4Hz）和空間分辨率（橫向分辨率約1.29μm，軸向分辨率約10.3μm）未達(dá)要求。

2、近年來(lái)的進(jìn)展與突破

2018年，Baris N.Ozbay等人開(kāi)發(fā)的頭戴式雙光子光纖耦合顯微鏡（2P-FCM）具有主動(dòng)軸向掃描功能，采用電潤(rùn)濕可調(diào)諧透鏡，操作簡(jiǎn)單、尺寸和重量小且不受振動(dòng)影響，能快速改變3D成像焦點(diǎn)。該系統(tǒng)使用柔性相干光纖束作為光學(xué)繼電器，結(jié)合臺(tái)式激光掃描雙光子顯微鏡，實(shí)現(xiàn)了大視場(chǎng)成像和一定深度的軸向掃描，成像橫向分辨率為1.8μm，軸向分辨率為10μm，*對(duì)自由移動(dòng)小鼠軀體感覺(jué)皮層神經(jīng)元成像。

2P-FCM 成像系統(tǒng)

2019年，Jin Cheng等人簡(jiǎn)化雙光子顯微鏡結(jié)構(gòu)，定制二向色性MEMS掃描儀，形成小型線陣掃描非線性光學(xué)顯微鏡，尺寸小（約7mm×6.5mm×3mm），重量輕（0.25g），成像速度高達(dá)每秒數(shù)千幀，可同時(shí)在單個(gè)動(dòng)物上安裝多個(gè)（*多4個(gè)）進(jìn)行成像。

ULSNLO成像系統(tǒng)

2017年，Chen等人推出基于MEMS掃描儀的*頭戴式雙光子顯微鏡，使用920nm光子晶體光纖傳輸飛秒激光脈沖，性能與大型臺(tái)式相當(dāng)，重量?jī)H2.15g，橫向分辨率和軸向分辨率分別為0.64μm、3.35μm，柵掃描頻率和線掃頻率較高，可對(duì)自由移動(dòng)小鼠中單棘活動(dòng)成像。2021年，該團(tuán)隊(duì)研發(fā)的第二代快速、高分辨率、小型化雙光子顯微鏡（FHIRM-TPM 2.0）成像視野擴(kuò)大，嵌入可拆卸快速軸向掃描模塊，實(shí)現(xiàn)了180μm深度的三維成像和多平面快速切換的實(shí)時(shí)成像，可長(zhǎng)期追蹤記錄神經(jīng)元，微型物鏡工作距離擴(kuò)展，變焦模塊可自由拆卸，新版成像探頭可整體即時(shí)拔插，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，視場(chǎng)旋轉(zhuǎn)角和邊界偏差小，增強(qiáng)了微型雙光子顯微鏡的適用性和實(shí)用性。

FHIRM-TPM 2.0成像系統(tǒng)

結(jié)與展望

多光子成像技術(shù)在腦科學(xué)研究中占據(jù)重要地位，其亞微米級(jí)空間分辨率、大成像深度、低生物損傷性和三維成像能力為研究大腦微觀結(jié)構(gòu)與生理過(guò)程、理解腦部疾病發(fā)病機(jī)制提供關(guān)鍵手段。

現(xiàn)有技術(shù)在成像深度上通過(guò)長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)、自適應(yīng)光學(xué)模塊和GRIN透鏡等提升，成像速度借助隨機(jī)掃描、多焦點(diǎn)成像和貝塞爾光束照明等提高，掃描機(jī)構(gòu)等小型化發(fā)展出頭戴式顯微鏡提高適用性。

未來(lái)，多光子成像將向多色成像（發(fā)展多波長(zhǎng)激光等光源）、大視場(chǎng)多腦區(qū)成像（開(kāi)發(fā)單個(gè)成像系統(tǒng)多區(qū)域成像技術(shù)）、集合多模態(tài)成像（結(jié)合其他技術(shù)增加探測(cè)維度）、結(jié)合5G與人工智能（實(shí)現(xiàn)高速數(shù)據(jù)傳輸與分析助力腦部疾病診斷）方向發(fā)展，盡管目前多光子腦成像研究在動(dòng)物模型應(yīng)用到人腦面臨困難，但隨著光學(xué)器件優(yōu)化及數(shù)據(jù)處理方法改進(jìn)，有望取得更多突破，為人類(lèi)健康和科學(xué)發(fā)展助力。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來(lái)源于：薛璐, 徐彬, 熊吉川, 劉學(xué)峰. 多光子顯微在腦成像中的應(yīng)用及進(jìn)展[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展, 2023, 60(20): 02.