光學(xué)顯微鏡是生物醫(yī)學(xué)研究必不可少的工具，其中雙光子顯微成像技術(shù)具有大深度三維顯微成像功能，被認(rèn)為是深層生物組織研究的*工具。

 

但是，在雙光子成像系統(tǒng)使用過程中，光學(xué)系統(tǒng)的裝配偏差、光學(xué)元件不理想以及生物樣品的不均勻性都會在成像過程中引入像差，從而降低成像質(zhì)量。通過在雙光子顯微成像系統(tǒng)中引入自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對像差的有效校正，從而提高成像的分辨率、深度和視場。

 

深圳的章辰、高玉峰團(tuán)隊(duì)在《激光》發(fā)表文章，介紹了雙光子顯微成像中的像差來源和特點(diǎn)，概述了自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)中不同的探測和校正方法，綜述了近年來自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)在雙光子顯微成像中不同的應(yīng)用成果，*對自適應(yīng)光學(xué)在雙光子顯微成像中的發(fā)展進(jìn)行了展望。

 

雙光子顯微成像技術(shù)

及其像差分析

 

雙光子顯微成像技術(shù)是基于雙光子效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。在一般情況下，熒光分子會吸收一個高能量的光子，從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，經(jīng)過一段弛豫時間后回到基態(tài)，同時輻射出一個能量比激發(fā)光光子能量小但是波長更長的光子，這就是單光子效應(yīng)。

 

然而，在高光子密度的條件下，熒光分子可同時吸收兩個能量較小、波長較長的光子，從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，隨后在激發(fā)態(tài)弛豫一段時間后再回到基態(tài)，這時輻射出能量比激發(fā)光光子能量高但是小于兩個光子能量和的光子，這就是雙光子效應(yīng)。

 

激發(fā)原理圖。（a）單光子激發(fā)原理示意圖；（b）雙光子激發(fā)原理示意圖

 

雙光子顯微成像系統(tǒng)中的像差主要有兩個來源：一是由光學(xué)系統(tǒng)裝調(diào)和光學(xué)元件不理想引入的像差，稱之為系統(tǒng)像差；二是由生物樣品的折射率不均勻性引入的像差，稱之為樣品像差。

 

其中，系統(tǒng)像差通常為固定的低階像差，不隨時間變化，因此可以通過對光學(xué)系統(tǒng)的優(yōu)化設(shè)計來減小像差，同時也可以預(yù)先測量、和補(bǔ)償像差。與系統(tǒng)像差相比，樣品像差除了大部分的低階像差以外，還包括更復(fù)雜的高階像差，這些像差通常會隨著成像深度的增加而增大。由于不同樣品或同一樣品不同區(qū)域的散射體大小和折射率不盡相同，不同樣品或同一樣品不同區(qū)域產(chǎn)生的像差也不一樣，因此樣品像差是無規(guī)律的、不可預(yù)測的，這也是雙光子顯微成像系統(tǒng)中*主要也是*難消除的像差。

 

雙光子顯微成像系統(tǒng)包含了激發(fā)光和發(fā)射光兩條光路，激發(fā)光在生物樣品上聚焦以激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。而生物樣品的折射率不均勻性會降低激發(fā)光的聚焦能力，進(jìn)而影響熒光發(fā)射。因此在進(jìn)行像差補(bǔ)償時，對激發(fā)光光路進(jìn)行像差校正是必須的。對于發(fā)射光而言，通常采用光電倍增管（PMT）進(jìn)行點(diǎn)探測成像，成像過程實(shí)際上是對熒光能量進(jìn)行收集，發(fā)射光光路中的像差對成像質(zhì)量的影響可忽略，因此無須對發(fā)射光光路進(jìn)行像差校正。

 

自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)

 

在AO技術(shù)中，通常把波前探測方法分為兩類：一類是使用波前傳感器（WS）基于幾何光學(xué)原理對波前進(jìn)行探測，稱之為直接波前探測；另一類是不使用波前傳感器，而是通過優(yōu)化算法對一系列圖像進(jìn)行計算，推導(dǎo)得出波前，稱之為間接波前探測。

 

間接波前探測

間接波前探測的概念*早來自1974年出現(xiàn)的像清晰化技術(shù)，但是隨著20世紀(jì)90年代后期硬件技術(shù)的革新和優(yōu)化控制算法的更新，間接波前探測的應(yīng)用才開始蓬勃發(fā)展起來。間接波前探測無需專門的波前傳感器，直接利用成像探測器獲得的光強(qiáng)信息建立像質(zhì)評價函數(shù)，然后基于特定的優(yōu)化算法在波前校正器上附加某些特定的相位，以尋找評價函數(shù)的極值，達(dá)到獲取*信號強(qiáng)度的目的，當(dāng)評價函數(shù)達(dá)到極值時認(rèn)為畸變波前已得到了校正。間接波前探測又可細(xì)分為搜索算法和模式法兩大類。

 

直接波前探測

直接波前探測是通過波前探測器和波前重建算法來獲得畸變波前的相位分布，然后將相位信息反饋給波前校正器，波前校正器產(chǎn)生一個與畸變波前互補(bǔ)的補(bǔ)償波前，從而達(dá)到波前校正的目的。常用的波前探測器是夏克-哈特曼波前傳感器（SHWS），其工作原理是首先利用微透鏡陣列把畸變波前分割成多個小塊并聚焦到照相機(jī)的靶面上，通過照相機(jī)采集各個焦點(diǎn)的空間位置信息，然后計算各個焦點(diǎn)與微透鏡陣列理想中心點(diǎn)的偏移量，得到畸變波前的斜率分布，*根據(jù)Zernike梯度多項(xiàng)式計算得到畸變波前的相位分布。

 

干涉測量技術(shù)

干涉測量技術(shù)是另一種非接觸、高精度的直接波前探測技術(shù)，目前在天文探測、光學(xué)元件精密制造、眼科治療等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。在干涉測量技術(shù)中，通常使用相移法使參考光與被測光之間產(chǎn)生穩(wěn)定變化的相位差，通過多幅相位差圖像計算出兩束光波前的相位差信息，再根據(jù)干涉測量的具體工作原理，得到被測光路中的畸變波前相位分布。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，干涉測量技術(shù)已從一種靜態(tài)測量技術(shù)發(fā)展為動態(tài)測量技術(shù)，其測量速度已使其可以用于活體成像。

 

波前校正方法

波前校正器是AO系統(tǒng)中進(jìn)行像差校正的執(zhí)行器件，通過改變?nèi)肷涔馐煌恢玫墓獬滩顏磉M(jìn)行畸變波前的相位補(bǔ)償。波前的畸變在本質(zhì)上是光程的差異，光程可表示為光在傳輸介質(zhì)中經(jīng)過的路程與傳輸介質(zhì)折射率的乘積，因此可以通過改變光在傳輸介質(zhì)中經(jīng)過的路程或改變傳輸介質(zhì)的折射率來對畸變波前進(jìn)行補(bǔ)償。

 

因此，波前校正器可分為兩類：一類是通過改變傳輸介質(zhì)折射率來實(shí)現(xiàn)相位補(bǔ)償?shù)牟ㄇ靶Ｕ?，如液晶空間光調(diào)制器（SLM）；另一類是通過改變光在傳輸介質(zhì)中經(jīng)過的路程來進(jìn)行相位補(bǔ)償?shù)牟ㄇ靶Ｕ?，如變形鏡（DM）。

 

SLM進(jìn)行相位調(diào)制是通過偏轉(zhuǎn)液晶面板上的雙折射液晶分子來實(shí)現(xiàn)的：在液晶面板的兩端施加不同的電壓，雙折射液晶分子隨著電壓的變化而產(chǎn)生不同的偏轉(zhuǎn)角度，使液晶面板的折射率發(fā)生變化，從而改變穿過液晶的光程，實(shí)現(xiàn)相位調(diào)制。此外，可以通過調(diào)制電壓獨(dú)立地改變SLM上每一個像素對應(yīng)的液晶分子折射率，實(shí)現(xiàn)高空間分辨率的相位調(diào)制。但是，SLM具有偏振依賴性，入射光必須為線偏振光才能實(shí)現(xiàn)相位調(diào)制，大大降低了器件的光能利用率。因此，在雙光子顯微成像系統(tǒng)中，必須提高激發(fā)光的功率，才能保證SLM校正后的激發(fā)光能量足以激發(fā)熒光。

 

DM是通過改變反射鏡的表面形狀來改變DM反射的光程，從而實(shí)現(xiàn)相位補(bǔ)償。根據(jù)驅(qū)動器的不同，常用的DM有微機(jī)電系統(tǒng)（MEMS）變形鏡和壓電陶瓷變形鏡。MEMS變形鏡采用的是微機(jī)電技術(shù)，主要由鏡面層、電極層和基底層組成，反射鏡為反射率較高的鍍鋁或鍍銀薄膜，在給電極層上分布的各個電極施加不同的電壓后，鏡面層與電極層之間會產(chǎn)生電勢差，從而產(chǎn)生靜電力吸附薄膜，使反射鏡產(chǎn)生形變。壓電陶瓷變形鏡是通過改變壓電驅(qū)動器的控制電壓來實(shí)現(xiàn)驅(qū)動器的伸縮，進(jìn)而帶動驅(qū)動器支撐的反射鏡產(chǎn)生形變。相比于SLM，DM的校正速度更快，也無偏振依賴性，但是DM的空間分辨率受驅(qū)動器個數(shù)的限制，且價格相對昂貴。

 

前沿應(yīng)用

 

具有高成像分辨率及大成像深度和視場的顯微成像技術(shù)一直是雙光子顯微成像乃至整個顯微成像領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其中AO技術(shù)在探測和校正像差中發(fā)揮了重要作用。自2000年AO技術(shù)首次被應(yīng)用于雙光子顯微成像以來，不同探測方法和校正方法的*應(yīng)用使得具有大視場、高成像分辨率的深層生物組織活體成像成為可能。

 

間接波前探測方法在雙光子顯微成像中的應(yīng)用

1.基于子孔徑分割的算法

Ji等提出基于子孔徑分割的間接波前探測算法，使用SLM調(diào)制波前相位，對小鼠大腦皮層切片產(chǎn)生的像差進(jìn)行預(yù)校正，能達(dá)到近衍射極限的成像分辨率；Tang等提出二分迭代法的間接波前探測算法，提高了波前探測速度和成像分辨率，實(shí)現(xiàn)了活體小鼠大腦皮層神經(jīng)元的成像；Wang等引入數(shù)字微鏡器件（DMD），縮短了校正時長，實(shí)現(xiàn)了活體小鼠大腦皮層神經(jīng)元的成像；Rodríguez等設(shè)計了更緊湊的子孔徑探測模塊，實(shí)現(xiàn)了活體小鼠大腦皮層和脊髓中神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)成像以及脊髓神經(jīng)元中鈣離子的功能成像，在三光子顯微成像系統(tǒng)中進(jìn)一步提升了成像深度；本課題組提出環(huán)形子孔徑分割算法，用于校正旋轉(zhuǎn)對稱像差，能達(dá)到近衍射極限的成像分辨率。

 

基于SLM間接波前探測的雙光子顯微成像系統(tǒng)。（a）子孔徑分割技術(shù)的工作原理；（b）系統(tǒng)校正和全局校正的置于250μm厚小鼠腦片下的直徑為1μm的熒光小球成像及全局校正波前圖

 

基于二分迭代法間接波前探測的雙光子顯微成像系統(tǒng)及其成像結(jié)果。（a）光路示意圖；（b）小鼠大腦皮層第5層神經(jīng)元的成像結(jié)果

 

基于DMD和SLM的子孔徑分割雙光子顯微成像系統(tǒng)及其成像結(jié)果。（a）光路示意圖；（b）校正前、后的活體小鼠大腦皮層第4、5層神經(jīng)元的成像結(jié)果

 

基于子孔徑分割的多光子顯微成像系統(tǒng)及其成像結(jié)果。（a）雙光子和三光子顯微成像系統(tǒng)的光路示意圖；（b）校正前、后活體小鼠大腦皮層和海馬體中神經(jīng)元的三光子顯微成像結(jié)果

 

2.基于模式法的算法

Park等提出基于模式法的間接波前探測方法，實(shí)現(xiàn)了大視場像差校正；Streich等將基于模式法的無波前探測技術(shù)引入到三光子顯微成像系統(tǒng)中，增大了成像深度；研究團(tuán)隊(duì)對視場進(jìn)行子孔徑分割，提高了視場邊緣的成像分辨率，實(shí)現(xiàn)了大視場成像。

 

間接波前探測方法結(jié)構(gòu)相對簡單，對成像對象無限制，易于實(shí)現(xiàn)，但波前校正過程計算量大、耗時長，很難滿足快速成像需求，測量精度低于直接波前探測。

 

基于環(huán)形子孔徑分割的雙光子顯微成像系統(tǒng)及其成像結(jié)果。（a）環(huán)形子孔徑分割的原理示意圖；（b）校正前、后小鼠大腦皮層神經(jīng)元的雙光子顯微成像結(jié)果

 

多孔徑間接波前探測技術(shù)的工作原理和成像結(jié)果。（a）多孔徑波前探測原理示意圖；（b）活體小鼠的大腦皮層神經(jīng)元成像結(jié)果

 

基于模式法的間接波前探測三光子顯微成像系統(tǒng)及其成像結(jié)果。（a）光路示意圖；（b）活體小鼠大腦海馬體神經(jīng)元的三光子顯微成像結(jié)果

 

大視場雙光子顯微成像系統(tǒng)及其成像結(jié)果。（a）光路示意圖；（b）校正前、后小鼠大腦切片的雙光子顯微成像結(jié)果

 

直接波前探測方法在雙光子顯微成像中的應(yīng)用

1.使用外源熒光物質(zhì)作為引導(dǎo)星

Cha等、Tao等在樣品里注射外源熒光物質(zhì)作為引導(dǎo)星，對離體小鼠大腦組織進(jìn)行成像，提高了成像分辨率，但該方法會對樣品產(chǎn)生干擾且引導(dǎo)星空間位置難控制，未被廣泛使用。

 

2.使用雙光子激發(fā)的熒光作為引導(dǎo)星

Wang等認(rèn)為雙光子激發(fā)的熒光可作為引導(dǎo)星，提出去掃描技術(shù)提高直接波前探測的質(zhì)量和效率，使用SLM對激發(fā)光進(jìn)行校正，對開顱活體小鼠大腦皮層神經(jīng)元進(jìn)行結(jié)構(gòu)成像，將引導(dǎo)星改為近紅外熒光蛋白，對活體小鼠大腦皮層神經(jīng)元中的鈣離子傳導(dǎo)進(jìn)行功能成像，成像深度達(dá)700μm；Liu等將近紅外熒光染料作為引導(dǎo)星，將波前校正器換成DM，對小鼠大腦皮層中的微血管和神經(jīng)元進(jìn)行結(jié)構(gòu)成像，成像深度可達(dá)1100μm，對神經(jīng)元釋放谷氨酸和鈣離子的過程進(jìn)行功能成像，提升了成像質(zhì)量；Qin等將DM置于去掃描后的探測光路中，實(shí)現(xiàn)了對激發(fā)光的迭代校正，優(yōu)化了波前重建算法和雙光子顯微成像系統(tǒng)中激發(fā)光的數(shù)值孔徑，降低了激發(fā)光的散射效應(yīng)，增加了探測深度，通過與光透明技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了小鼠顱骨完整狀態(tài)下大腦皮層神經(jīng)元的成像，成像深度為700μm。

 

基于直接波前探測的雙光子顯微成像系統(tǒng)及其成像結(jié)果。（a）光路示意圖；（b）校正前、后果蠅胚胎的雙光子顯微成像結(jié)果

 

基于SHWS和SLM直接波前探測的雙光子顯微成像系統(tǒng)及其成像結(jié)果。（a）光路示意圖；（b）校正前、后小鼠大腦皮層神經(jīng)元的雙光子顯微成像結(jié)果

 

基于SHWS和DM直接波前探測的雙光子成像系統(tǒng)及其成像結(jié)果.（a）光路示意圖；（b）系統(tǒng)校正和全局校正后的小鼠大腦皮層樹突棘的雙光子顯微成像圖；（c）校正后的小鼠大腦皮層神經(jīng)元的雙光子顯微成像圖

 

基于數(shù)值孔徑優(yōu)化算法和直接波前探測的雙光子顯微成像系統(tǒng)及其成像結(jié)果。（a）數(shù)值孔徑優(yōu)化示意圖；（b）校正前、后活體小鼠腦膜下方神經(jīng)元的雙光子顯微成像圖

 

直接波前探測方法能夠得到畸變波前的客觀描述，測量速度更快、準(zhǔn)確度更高，但系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，會降低成像信噪比，波前探測器的靈敏度和探測精度也會受信噪比影響。

 

F-SHARP技術(shù)在雙光子顯微成像中的應(yīng)用

1.技術(shù)原理

adopoulos等提出聚焦掃描全息像差探測（F-SHARP）方法，通過雙光束干涉直接測量畸變波前的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF），并使用測量得到的PSF相位的共軛來校正波前。

 

2.應(yīng)用進(jìn)展

Qin等在F-SHARP系統(tǒng)中將遠(yuǎn)程聚焦方法與共軛AO相結(jié)合，使用鎖相放大器簡化PSF的測量步驟，提高了畸變波前的測量速度和準(zhǔn)確度，將改進(jìn)后的F-SHARP技術(shù)應(yīng)用于三光子顯微成像系統(tǒng)中，實(shí)現(xiàn)了小鼠大腦皮層神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)成像和海馬體的高分辨率成像。

 

基于F-SHARP的雙光子顯微成像系統(tǒng)及其成像結(jié)果。（a）光路示意圖及F-SHARP工作原理；（b）校正前、后小鼠大腦皮層神經(jīng)元的雙光子顯微成像圖

 

基于共軛AO和鎖相放大器的F-SHARP三光子顯微成像系統(tǒng)及其成像結(jié)果。（a）光路示意圖；（b）系統(tǒng)校正和全局校正后的活體小鼠大腦皮層的雙光子顯微成像圖

 

3.技術(shù)特點(diǎn)

無需專門的波前傳感器，將發(fā)射光全部用于成像，保證了成像信噪比；使用雙光束干涉技術(shù)，部分激發(fā)光功率損失，但探測時間大幅縮短，與快速相移技術(shù)結(jié)合，探測速度進(jìn)一步提升。

 

結(jié)與展望

 

具有更大成像視場、更深成像深度和更高成像分辨率的雙光子顯微成像系統(tǒng)可為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究提供更豐富、準(zhǔn)確的影像信息，AO技術(shù)將在顯微成像領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，為成像質(zhì)量的突破提供技術(shù)支持。未來，加快畸變波前的探測和校正速度、提升校正的動態(tài)范圍是實(shí)現(xiàn)活體快速成像的必經(jīng)之路，將各種探測、校正和控制技術(shù)有效結(jié)合，以及與其他技術(shù)融合，將是研究的重點(diǎn)。

 

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于:章辰, 高玉峰, 葉世蔚, 李慧, 鄭煒. 自適應(yīng)光學(xué)在雙光子顯微成像技術(shù)中的應(yīng)用[J]. 激光, 2023, 50(3): 0307103. Chen Zhang, Yufeng Gao, Shiwei Ye, Hui Li, Wei Zheng. Application of Adaptive Optics in Two?photon Microscopic Imaging[J]. Chinese Journal of Lasers, 2023, 50(3): 0307103.